Tianji MA
a soutenu sa thèse le jeudi 14 novembre 2019
Fonctionnalisation de nanopore unique par des polymères : conformation, transport et applications
devant le jury composé de :
– M. Bernard TINLAND, Directeur de Recherche, CNRS, CINaM – Rapporteur
– M. Laurent BACRI, Maître de conférences, Université d’Évry – Rapporteur
– M. Juan PELTA, Professeur, Université d’Évry – Examinateur
– Mme Sophie TINGRY, Directrice de Recherche, CNRS, IEM – Examinateur
– Mme Mathilde P. LEPOITEVIN, Maître de conférences, ENS Paris – Examinateur
– M. Sébastien BALME, Maître de conférences, Université de Montpellier – Directeur de thèse
Résumé :
Les canaux biologiques sont des protéines de pores situées sur la membrane cellulaire pour maintenir l’équilibre des ions et le transport des molécules. Ces canaux protéiques peuvent répondre à de multiples stimuli tels que la lumière, le pH, la force des ions et le potentiel transmembranaire pour réguler leur perméabilité et leur sélectivité. Pour imiter ces pores biologiques, des nanopores artificiels ont été fabriqués et une technologie à base de nanopores a été développée pour le séquençage de l’ADN, la détection de biomolécules et la récupération d’énergie osmotique. Les avantages des nanopores artificiels à base de matériaux solides ou polymères sont la simplicité de fabrication et la stabilité mécanique et chimique. Cependant, les faiblesses sont également évidentes: ils ont généralement moins de sélectivité et de réactivité face aux stimuli externes. Pour améliorer leurs applications, la fonctionnalisation devient essentielle. La fonctionnalisation de la surface des nanopores peut modifier leurs propriétés telles que la perméabilité, la sélectivité ou leur donner la capacité de détecter des biomolécules spécifiques, afin d’étudier le transport ionique / moléculaire fondamental dans des situations spécifiques.
Dans cette thèse, nous avons cherché à améliorer la fonctionnalisation des nanopores pour trois applications: canal ionique sensible aux stimuli, récupération de l’énergie osmotique et biosensing. Pour les canaux ioniques sensibles aux stimuli, nous avons construit deux canaux: l’un est sensible au pH et fonctionnalisé par auto-assemblage couche par couche de polyélectrolytes dans des nanopores track-etched et l’autre peut répondre à la lumière et au pH sur la base d’un greffage chimique de chaînes spiropyran-PEG. L’isomérisation induites par la lumière et la protonation / déprotonation causées par le changement de pH peuvent modifier la charge et la conformation de molécules fonctionnelles. Ainsi, ces changements peuvent moduler la perm-sélectivité des ions du canal. Pour la récupération d’énergie osmotique, nous avons conçu deux stratégies pour améliorer la sélectivité ionique de la membrane afin d’obtenir un rendement énergétique supérieur. L’une utilisait le dépôt couche par couche de polyélectrolytes sur la surface des pores pour améliorer la densité de charge, et une autre utilisait un hydrogel hautement chargé synthétisé à l’intérieur des pores. Les résultats ont montré une production d’énergie élevée pour les deux stratégies de 20 pW par pore. La fonctionnalisation en hydrogel permet d’utiliser une géométrie cylindrique adéquate pour une membrane à haute densité de pores. Pour la biodétection, nous avons développé un nanopore fonctionnalisé par PLL afin de détecter la contamination par les OSCS dans des échantillons d’héparine sur la base des principes de la diode ionique. Après avoir été traitée aux héparinases, la concentration en héparine dans les résidus peut refléter la concentration en OSCS, car celle-ci peut bloquer les héparinases. La concentration en héparine peut ensuite être caractérisée quantitativement par un nanopore fonctionnalisé par PLL basé sur le changement ICR. Cette expérience a confirmé l’aptitude d’un nanopore gravé sur piste à caractériser la cinétique de dégradations enzymatiques. Pour aller plus loin, nous avons immobilisé des hyaluronidases dans le canal afin de caractériser les réactions enzymatiques au niveau d’une molécule à l’aide d’une impulsion résistive. Les résultats ont montré que la durée du complexe entre une hyaluronidase et une molécule d’acide hyaluronique pour une réaction est d’environ 1 seconde.
Dans cette thèse, nous montrons la forte capacité des nanopore track-etched fonctionnalisés par polyélectrolytes. Ces systèmes bien conçus peuvent être facilement mis à l’échelle et ces principes bien développés peuvent être utilisés pour concevoir d’autres systèmes afin de résoudre plus problèmes de santé et d’énergie.
Abstract:
Biological channels are pore proteins on the cell membrane to keep ion equilibrium and molecule transport. These protein channels can respond to multiple stimuli like light, pH, ion strength and trans-membrane potential to regulate their permeability and selectivity. To mimic these biological pores, artificial nanopores have been fabricated and nanopore technology has been developed for DNA sequencing, biomolecule detection and energy harvesting. The advantages of artificial nanopores based on solid or polymer materials are simplicity of fabrication and mechanical, chemical stability. However the shortcomings are also clear that they usually have less selectivity and responsiveness to external stimuli. To enhance their applications, the functionalization becomes vital. Functionalization of the nanopore surface can change their properties like permeability, selectivity or give them abilities to detect specific biomolecules, to study fundamental ion/molecule transport in specific situations.
In this thesis, we aimed to improve nanopore functionalization for three applications: stimuli-responsive ion channel, osmotic energy harvesting and biosensing. For stimuli-responsive ion channel, we constructed two channels: One is responsive to pH and functionalized by layer-by-layer self-assembly of polyelectrolytes in track-etched nanopores and the other one can respond to light and pH based on chemical grafting of spiropyran-PEG chains. Light induced isomerization and protonation/deprotonation caused by pH change can change the charge and conformation of functional molecules. Thus these changes can modulate ion perm-selectivity of the channel. For osmotic energy harvesting, we designed two strategies to improve ion selectivity of membrane to get higher energy output. One used layer-by-layer depositing of polyelectrolytes on pore surface to enhance charge density and another one used a high charged hydrogel synthesized inside the pore. Results showed a high energy generation for both two strategies of 20 pW per pore. The hydrogel functionalization makes it possible to use cylindrical geometry which is adequate for high pore density membrane. For biosensing, we developed a PLL functionalized nanopore to detect OSCS contamination in heparin samples based on ionic diode principles. After being treated by heparinases, the heparin concentration in residue can reflect the OSCS concentration as OSCS can block heparinases. The heparin concentration can then be characterized quantitatively by PLL functionalized nanopore based on ICR change. This experiment confirmed the ability of track-etched nanopore to characterize the kinetics of enzymatic degradations. To go further, we immobilized hyaluronidases in the channel to characterize the enzymatic reactions at single molecule level using resistive pulse. The results showed that the duration of complexion between one hyaluronidase and one hyaluronic acid molecule for one reaction is around 1 second.
In this thesis, we show the strong ability of polyelectrolytes functionalized track-etched nanopore.
These well-designed systems can be easily scaled up and these well-developed principles can be used
to design other systems to solve more problems in health and energy.
